1                  适用范围

Ø  本SOP适用于安捷伦NovoCyte Quanteon流式细胞仪使用及维护保养。

2                  生效日期

Ø  本SOP文件自2020年4月4日生效。

操作人员要求：需通过科研中心流式培训考核授权

一、仪器开机与前期检查

（一）开机前预检查

1.      设备连接：确认主机、工作站、流体工作站、显示器的电源线、数据线（USB/DVI/网口）连接牢固，无松动、弯折；选配NovoSampler Q时确认其与主机COM1口连接正常。

2.      试剂与废液：检查NovoFlow鞘液（≥0.9L）、NovoRinse冲洗液（≥150mL）、NovoClean清洗液（≥150mL）液位，废液瓶容量＜2.8L；若试剂不足按要求补充，废液超量则清空并加入300mL漂白剂。

3.      环境与安全：确认操作环境温度15-32℃、相对湿度≤80%，无易燃/腐蚀性气体；仪器接地良好，操作台面整洁，佩戴手套/护目镜等防护用品。

（二）开机步骤

1.      打开稳压电源，按下主机前面板电源开关，电源指示灯亮绿色，仪器进入初始化（自动清洗流路、预热激光器）。显示器电源连接的是蓝牙电源开关，需易控扫码使用。

2.      启动NovoCyte工作站及显示器，双击桌面NovoExpress软件，选择用户名登录，软件状态栏显示Initializing，完成后显示Ready即为开机成功。

3.      若软件显示仪器未连接：检查USB线连接、关闭多开的NovoExpress实例，重启软件或工作站。

（三）开机后QC校准

要求：每日开机后、实验前必须执行QC测试，确保仪器性能达标。

1.      准备1mL安捷伦专用QC微球样品，充分混匀后置于样品架。

2.      在NovoExpress软件中点击Instrument > QC Test，按提示填写测试信息，点击Run。

3.      仪器自动调整光电探测器增益，完成后生成QC报告，所有通道结果需为Pass；若为Failed，重新制备QC样品复测，连续3次失败联系安捷伦技术支持。

二、实验参数设置与样品检测

（一）实验文件创建

1.      软件自动新建未命名实验文件（*.ncf格式），点击File > Save命名并保存（建议格式：实验名_日期.ncf）。

2.      点击Next Sample或右键实验文件，新建Group（组）-Specimen（标本）-Sample（样品） 层级结构，重命名对应样品/标本（便于数据管理）。

（二）检测参数设置

1.      选择检测通道：双击目标样品设为Active Sample，在Cytometer Setting > Parameters面板，勾选所需FSC、SSC及荧光通道的Height/Area参数（未勾选参数不采集，避免文件过大），可在Alias列修改通道别名（如B525改为CD3-FITC）。

2.      停止条件：在Stop Condition面板设置，支持事件数（总事件/指定门内事件）、时间、体积单/多条件组合，满足任一条件即停止采集（新实验建议先预跑10μL确定最佳条件）。

3.      流速设置：在Flow Rate面板选择，默认三档：Slow（14μL/min，芯径7.7μm）、Medium（35μL/min，芯径12.2μm）、Fast（66μL/min，芯径16.8μm）；也可手动调节5-120μL/min，高分辨率实验（如DNA分析）用Slow，高通量定性实验用Medium/Fast。

4.      阈值设置：在Threshold面板设置，主阈值建议选FSC-H，副阈值可选SSC-H/荧光通道，仅采集超过阈值的信号；根据样品类型参考推荐阈值（如下），新实验可通过Adjust on Plot实时调整。

样品类型	FSC-H阈值	备注
白细胞/脾细胞	50,000~200,000	线性/对数刻度均可
细胞系（＜20μm）	100,000~300,000	线性/对数刻度均可
血小板	5,000~10,000	建议用对数刻度
细菌	1,000~10,000	加SSC-H＞5,000为副阈值

（三）样品上机检测

1.      样品前处理：待测样品浓度调整为1×10⁶~5×10⁶ cells/mL，充分混匀后经300目筛网过滤去除凝块；去除样品管盖，置于样品架指定位置。

2.      启动采集：点击软件Cytometer Control > Run，样品进样针（SIP）自动下移吸样，状态栏实时显示采集事件数、流速、体积。

3.      中途操作：采集过程中可点击Restart重新采集（清除已有数据），或Stop手动停止；多样品检测按顺序放置，仪器自动完成后清洗SIP（交叉污染率＜0.1%）。

4.      数据保存：软件自动保存采集数据，实验结束后手动保存分析结果（含门、补偿、统计图），避免数据丢失。

三、数据处理与文件管理

（一）数据可视化与分析

1.      绘制统计图：在软件分析工具栏选择点图、密度图、直方图、等高线图等，拖拽参数设置横/纵轴，可通过Zoom In/Out放大目标群体。

2.      设置分析门：支持矩形门、椭圆门、多边形门、象限门等，圈选目标细胞群体（如淋巴细胞门），门内数据可自动统计事件数、百分比、MFI、CV等指标。

3.      批量分析：创建分析模板（含门、统计图、统计指标），拖拽应用至其他样品，实现批量数据处理。

（二）文件导入与导出

1.      导出：右键样品/标本，选择Export > Export FCS File（支持FCS3.0/3.1，兼容FlowJo等第三方软件）或Export CSV File；也可在Setting > Option > Experiment中勾选自动导出，采集完成后自动生成文件。

2.      导入：右键空白样品/标本，选择Import > Import FCS File，可导入外部FCS文件进行分析。

（三）数据备份

实验数据自动保存至工作站硬盘，需定期将.ncf、FCS/CSV文件备份至服务器/移动存储设备*，防止硬盘损坏导致数据丢失。

四、仪器关机与日常清洁

（一）关机步骤

1.      每日最后一位使用者，需负责关机，关机前需确保洗液，鞘液足够，废液桶未满。

2.      所有样品检测完成后，在NovoExpress软件中点击Instrument > Shut Down，或按下主机电源开关，仪器指示灯闪烁绿色，执行自动关机清洗（流路冲洗、SIP清洁）。

2.      清洗完成后仪器自动断电，指示灯熄灭，关闭NovoExpress软件、工作站及显示器电源。

3.      补充NovoFlow、NovoRinse、NovoClean试剂至满容，清空废液瓶并清洗、晾干。

（二）即时清洁

1.      样品检测间隙，用PBS冲洗流路30秒，去除残留样品；

2.      若样品含高生物毒性/传染性物质，检测后立即执行Decontamination（去污）程序（需启用对应权限，按软件指引操作，约3小时）。

五、仪器维护

（一）定期维护（按频率执行，记录维护日志）

维护项目	频率	操作要点
试剂补充/废液清空	每次实验前	鞘液≥0.9L，冲洗液/清洗液≥150mL，废液＜2.8L
QC测试	每日开机后	确保所有通道Pass，异常及时排查
SIP及SIP清洁装置擦拭	每月	用NovoClean浸湿的棉签轻擦SIP外壁及清洁装置，避免弯折SIP
流路疏通/清洗	每月	软件中执行Unclog（疏通）、Cleaning（清洗）程序
试剂瓶灭菌	每月	用NovoClean浸泡试剂瓶30min，超纯水冲洗3次，晾干后归位
流路耗材更换	软件提示	更换鞘液在线过滤器、废液过滤器、各试剂入口过滤器，更换后执行Priming+QC

（二）非计划维护（异常时执行）

1.      除泡（Debubble）：数据CV异常、QC失败、采集无事件时，执行Instrument > Fluidics Maintenance > Debubble。

2.      流路灌注（Priming）：补充试剂、更换过滤器后，执行Priming排除管路气泡，确保流路充满试剂。

3.      长期存放（＞2周）：用超纯水替换所有试剂，执行2次Priming，关机后清空试剂瓶并晾干，置于1-40℃环境。

4.      长期存放后重启：灭菌试剂瓶，重新加入试剂，开机后执行2次Priming+QC测试，确认性能达标。

5.      流体工作站校准：试剂液位误报警时，执行Instrument > Operation > Calibrate Fluidics Station，按软件指引操作。

（三）维护注意事项

1.      更换耗材/清洁时，确保仪器处于Ready或关机状态，避免操作中损伤部件；

2.      接触SIP、试剂瓶、废液瓶时必须佩戴手套，生物废料按当地法规处理；

3.      禁止用异丙醇/乙醇擦拭仪器表面，可用NovoRinse浸湿的软布清洁。

六、常见故障排查

（一）核心故障排查指引（按优先级处理）

故障现象	可能原因	推荐解决方案
QC测试失败	QC微球过期/流路有气泡/流路堵塞/滤光片污染	更换新QC微球；执行Debubble；执行Unclog；清洁/更换滤光片
采集无事件/事件数极低	阈值过高/样品浓度过低/样品未混匀/SIP堵塞	降低阈值；浓缩样品；充分混匀；用NovoClean冲洗SIP
数据CV值偏高	流路有气泡/流速过高/样品凝块/流路脏	执行Debubble；降低流速；过滤样品；执行Cleaning
数据背景碎片多	阈值过低/鞘液过滤器脏/流路脏	提高FSC-H阈值；更换鞘液在线过滤器；执行Cleaning/Rinse
软件显示仪器未连接	USB线松动/工作站休眠/多开软件	重新插拔USB线；唤醒工作站；关闭多余NovoExpress实例，重启软件
进样针漏液	废液管弯折/废液过滤器堵塞	整理废液管避免弯折；更换废液过滤器
荧光信号不稳定/数据有间隙	流路有气泡/样品管不匹配	执行Debubble；使用12×75mm或1.5/2.0mL指定样品管

（二）故障升级

若按上述方法排查后故障仍未解决，或出现仪器报错红灯、激光/光学部件损坏、流路严重泄漏等情况，禁止自行拆卸仪器，立即联系安捷伦技术支持：

•        中国区：800-820-3278（固话）/400-820-3278（手机）

•        提供信息：仪器型号/序列号、使用历史、软件报错信息、QC结果、实验参数。

七、安全注意事项

1.      激光安全：仪器为Class I激光产品，激光完全封闭，禁止拆卸光学盖/激光屏蔽罩，避免激光辐射损伤眼睛/皮肤。

2.      电气安全：仪器必须接地，禁止使用无接地电源；禁止湿手操作电源，电源线破损立即更换（仅用安捷伦原装线）。

3.      生物安全：所有生物样品按潜在感染性物质处理，佩戴防护用品；废液/污染耗材按当地生物安全法规处理，禁止随意丢弃。

4.      机械安全：仪器运行时避免接触SIP及运动部件，防止夹伤；更换样品管时确保SIP复位，避免碰撞损坏。

5.      化学安全：使用NovoClean、漂白剂等试剂时，避免接触皮肤/眼睛，不慎接触立即用大量清水冲洗，必要时就医。

6.      仪器搬运：仪器重47kg（含NovoSampler Q为60kg），搬运需2人以上，按说明书操作；禁止自行拆卸搬运，必要时联系安捷伦专业人员。

八、记录与追溯

1.      建立仪器使用日志，记录开机/关机时间、操作人员、检测样品、QC结果、故障及处理情况；

2.      建立维护日志，记录定期/非计划维护的时间、项目、耗材更换情况；

3.      实验数据、QC报告、维护记录需至少保存3年，便于追溯与审计。