2 生效日期

Ø 本SOP文件自2014年5月20日生效

3 使用范围

Ø Mini-PROTEAN 3 CELL可用于手工灌胶电泳和预灌胶的电泳。

4 操作

4.1 玻璃盒和灌胶台组装

Ø 把灌胶架直立放在一平坦表面上，压力板处于打开位置。

Ø 选出所需厚度胶的隔片玻板，放一个短玻板在上面。

Ø 调整隔片玻板方向，以使标记是“上”。把这两个玻板轻轻放入灌胶架，使短玻板正对灌胶架前面。确保这两块板在一个水平面上齐平以及隔片玻板上的标记方向正确以免灌胶时漏胶。

Ø 放好玻璃板后，旋转压力板把玻璃盒夹心紧扣在灌胶架中。

Ø 调节弹簧负载杆，把凝胶盒装置放在灰色灌胶台垫子上。确保灌胶架背面的水平肋状物与灌胶台表面齐平，及玻板垂直于水平面。负载杆把隔片玻板向下推向灰色橡皮垫子。

Ø 重复操作，制作第2块胶。

4.2 非连续性聚丙烯酰胺凝胶灌胶

Ø 把梳子完全放入装配好的凝胶盒，在梳齿下方1cm处的玻璃板上做上标记，以次作为分离胶灌注的平面。取掉梳子。

Ø 准备分离胶溶液，将混匀后的分离胶溶液用加样枪灌注到记号处。

Ø 立即用水覆盖单体溶液；加入覆盖液时要慢而平稳，以免其与分离胶混合；禁止用戊/丁醇或异丁醇覆盖。

Ø 让凝胶聚合45min到1h；聚合完全后用蒸馏水冲洗整个凝胶表面；此时可加入5ml 1X分离胶缓冲溶液到分离胶表面使之在室温下保存过夜。

Ø 插入一张滤纸以吸干分离胶上方两玻璃板间的水或缓冲液，注意不要触及凝胶表明。

Ø 准备堆积胶单体溶液，将混匀的堆积胶缓冲液连续灌注到短玻板顶端。

Ø 在隔片玻板顶部的两隔片之间插入合适的梳子；梳子边缘与短玻板上缘在一条直线上。

Ø 让堆积胶聚合30-45min。

Ø 轻轻取出梳子，用蒸馏水或电泳缓冲液冲洗整个加样孔。

Ø 使用后用蒸馏水、去离子水冲洗灌胶架和灌胶台。

4.3 连续性聚丙烯酰胺凝胶灌胶

Ø 准备分离胶溶液，将混匀后的分离胶溶液用加样枪连续灌注一直到达短玻板顶端。

Ø 在隔片玻板顶部起始的两隔片之间插入合适的梳子；梳子边缘与短玻板上缘在一条直线上。

Ø 让堆积胶聚合45min-1h。.

Ø 轻轻取出梳子，用蒸馏水或电泳缓冲液冲洗整个加样孔。

Ø 使用后用蒸馏水、去离子水冲洗灌胶架和灌胶台。

4.4 电泳模具装配

Ø 从灌胶台上取下凝胶盒装置。朝内旋转凸轮，松开凝胶盒夹心。

Ø 在电极装置两边的底部分别放入一个凝胶盒夹心或在一边放入缓冲液挡板，另一边放凝胶盒夹心。确保凝胶盒夹心的短玻板朝内对着U形垫子的凹口。

Ø 把凝胶盒夹心靠着绿色垫子放入，轻轻滑入固定架。

Ø 关闭固定架的两个凸轮杆的同时向下压电极装置以形成内槽。确保短玻板在U形垫子切迹的完全密封。短玻板必须与垫子的切迹对准。

Ø 把内槽向下放入微型槽。往内槽倒入电泳缓冲溶液直到液面达到凝胶盒长短玻板两顶端之间。

Ø 加入200ml电泳缓冲液入微型槽（较低缓冲槽）。

4.5 上样

Ø 用Hamilton注射器或用凝胶上样枪头的移液管把样品加入加样孔中。

Ø 如使用伯乐的专利上样导轨，把它放在电极装置中的两胶之间。上样导轨适用于9、10、12和15孔板式。

Ø 用上样导轨来定位加样孔。把Hamilton 注射器或移液枪尖插入导轨的孔里，填充对应的加样孔。注意：慢慢上样，让它们平稳地下沉到加样孔的底部。小心不要用注射针头或移液枪尖刺穿加样孔的底部。

4.6 电泳

Ø 把盖子放在微型槽上，确保标记在banana插头和插孔上的颜色一致。

Ø 把电源线按正确的电极插入一个适合的供电装置。

Ø 接通Mini-PROTEAN 3 CELL的电源，开始电泳；对于SDS-PAGE和大多数天然凝胶设备推荐使用200伏稳压，SDS-PAGE在200伏时电泳时间约为35min。

Ø 电泳结束后，关掉电源，断开电线。

Ø 打开盖子，小心取出内槽装置，倒掉和清除电泳缓冲溶液。

Ø 打开固定架的凸轮轴，把电极装置从固定架中取出，取下凝胶盒夹心。

Ø 用楔形绿塑料板撬开两玻璃板。

Ø 沿每个隔片移动楔形绿塑料板的锐缘或刮胡刀片，把凝胶从隔片上分离开；在定色剂或转移液中倒置凝胶和玻板，轻轻搅动直到凝胶从玻板上分离开。

Ø 使用后用蒸馏水、去离子水冲洗Mini-PROTEAN 3 CELL电极装置、固定架和微型槽。

5 注意事项：

Ø 选用干净的玻板。

Ø 隔片玻板方向正确，两玻板底部平齐。

Ø 凝胶加入玻璃盒前必需混匀。

Ø 液封时小心操作，不要将水和凝胶混在一起。

Ø 在加积层胶前，用水冲洗浓缩胶，除去未聚合凝胶，然后用滤纸洗干残留水。

Ø 插梳子时，先将一端插入，然后插入另一端可避免产生气泡。